Nature文章-PTI影响ETI

CNS顶刊的文章，光看就很费劲，顶刊就是顶刊。

这是特殊的一段时间，答辩+拍照+聚餐+其他=毕业。在这个特殊的时间段，总是不能收心好好学习，一篇Nature的文章看几天都看不完。研究生三年，断断续续看了一些文献，都不成章法，就用这篇文章来总结一下自己看文献的思路和流程吧。

阅读顺序

我现在阅读文献的顺序基本是固定的，拿到文章先看标题，然后是摘要，要是看完摘要觉得有用的话再扫一眼图表，要是觉得都很OK，那就精读。精读的文献我会关注如下的内容：

每篇文献阅读完成呢我会关注如下的一些东西，包括文章内容有何不足之处、背景方面的积累、有什么新的研究方法、写作手法等。除此之外呢我还会关注文章中用到的软件、算法及特别吸引人的图表等。除了这些之外，文末的参考文献也是很值得关注的，从参考文献就能挖掘到不少东西。

如何get最新文献

现在对我来说就两个途径：微信公众号和Stork。微信公众号推送的文献会很及时，也会有关键的解读，文章质量也是结果筛选的；Stork推送的文献就很新，我通常是浏览标题，看到感兴趣的看看摘要，要是看了摘要还很OK的话就下载下来精读。

我是这样看文献的

下面就以Pattern-recognition receptors are required for NLR-mediated plant immunity为例，简单说说我的阅读过程。

这个文献的最初是从微信公众号看到的，毕竟是Nature上的文章，而且还是经典之作。

首先看标题，文章的标题其实就是文章的主要内容：NLR介导的植物免疫需要模式识别受体的参与。然后顺便扫一眼作者：

Minhang Yuan,

Zeyu Jiang,

Guozhi Bi,

Kinya Nomura,

Menghui Liu,

Yiping Wang,

Boying Cai,

Jian-Min Zhou,

Sheng Yang He &

Xiu-Fang Xin

至少看到了几个植物免疫领域的杰出科学家：周俭民老师和何胜洋老师。（PS：有时候看看作者就知道往后应该多关注哪些研究者/研究机构）。

接下来是看摘要：

首先说了植物免疫对作物生产的重要性，然后阐述植物免疫由PTI和ETI两部分组成，紧接着就说PTI和ETI是由什么诱导激发的，最后引用文献说明PTI和ETI的激发机制和信号级联途径是不一样的。在说完这些背景后，就开始阐述研究结果，最后下结论：这个研究结果有什么用。

既然是精读的文章，那就从前言开始吧（PS：每个研究都是一个完整的故事，如果是跳跃阅读，那很可能无法把整个故事线串起来。）。

PRRs是具有胞外配体结合阈的类受体激酶和蛋白（RLKs和RLPs）。PRRs能够感知多类微生物保守的分子模式。与PRRs相反的是，NLRs（主要）是胞内的蛋白，能够识别病原物释放进入细胞内的效应子。这些NLRs可以根据其N端结构阈分成CC型、TIR型及CC$_R$型。PRRs和NLRs信号激发的下游细胞响应大部分是重叠的，如防御相关基因表达、ROS产生及胼胝质沉积等。但是呢细胞表面和内部感知系统之间潜在的信号合作机制还不清楚。

顶刊的前言是真的短。从前言部分就能看出这个研究要解决的就是PTI和ETI之间的关系。

选用拟南芥-丁香假单胞菌互作系统为整个研究的研究系统。

先是选用一个无毒且能够激发野生型植株发生ETI的菌株DC3000(avrRpt2)。但是用这个菌侵染两个PRR/共受体突变体植株（不能有效识别细菌相关的分子模式）时，并没有激发有效的ETI（下图a）。这个图a怎么看呢？横坐标表示的是不同的植株，第一个是野生型，另外两个是突变体，不同颜色表示的是不同菌株。可以看出DC3000(avrRpt2)激发寄主的ETI后，侵染部位的菌量显著减少。但是在突变体中，DC3000(avrRpt2)侵染后侵染部位的菌量比野生型多很多。虽然和DC3000侵染后形成的菌量有显著差异，但是比野生型多很多。从这个结果能得到什么结论呢？是“PRR/共受体调控ETI”还是“PRR/共受体参与ETI”呢？似乎还只能说PRR/共受体可能参与了ETI。为了进一步说明这个结果，还做了更多的处理（下图b）。ETI期间的超敏反应会导致寄主细胞的快速死亡。从表型（下图c）可以看到的是，在野生型植株中，DC3000(avrRpt2)侵染后几乎所有的叶片都“塌陷”（tissue collapse）了；但是两个突变体植株的叶片的“塌陷”情况缓解了很多。

那上面这些结果是想要表达什么呢？其实就是想说PRR/共受体影响ETI。到这里下一步该怎么办呢？是不是应该拿到更多更细的数据说明PRR/共受体确实影响了ETI呢？DC3000是研究拟南芥-细菌互作的模式菌株，研究其激发拟南芥ETI的机制。单是之前的研究发现野生型DC3000体内的36个效应子基因的效应子会干扰拟南芥的PTI和ETI。那就需要找一个完美的菌，也就是找个只能激发PTI和只能激发ETI的菌。选用的菌是D36E，这个菌没有DC3000的36个效应子基因，也没有冠菌素生物合成基因，只能激发寄主的PTI响应；而D36E(avrRpt2)只能合成分泌一个效应子AvrRpt2，不但能激发PTI，还能激发ETI。D36E毒性比DC3000若很多，但是D36E(avrRpt2)还是能显著地激发ETI（最左边的两个柱子）。但是在两个突变体中，D36E(avrRpt2)释放的效应子AvrRpt2激发的ETI几乎检测不到。其实这也再次说明当寄主没有PRR/共受体的时候，效应子激发的ETI是很弱的。

PTI和ETI过程都会有大量ROS生成，ROS可以直接杀菌，也能作为信号物质激发下游更多的免疫响应。植物病原互作基本都会选择ROS作指标。这个研究也对ROS进行检测了。使用的植物材料很特殊，是Dex:avrRpt2，这个是啥意思呢？表示的是avrRpt2这个基因的表达会被一个由地塞米松诱导的启动子驱动表达，也就是说地塞米松能够诱导avrRpt2这个基因表达，从而激发ETI。用不同的激发子处理拟南芥叶片。从下图c可以看到的是flg22和flg22+地塞米松都能能够有效地激发ROS的生成，大概在35min的时候达到第一个峰值。地塞米松单独激发的情况下，第一个时间段并没有出现ROS峰值。flg22单独诱导的时候会出现第二个峰至，但是明显比flg+22激发的ROS少。这表明flg22激发的ROS（PTI$^{ROS}$）是在35min内生成的。flg22+地塞米松诱导生成的ROS简写为ETI$^{ROS}$。ETI$^{ROS}$大概在处理后2-3h发生，并且持续较长时间。比较有趣的是，单独地塞米松诱导激发的时候第二阶段产生的ROS很少，还没有 flg22激发的PTI在第二阶段产生的ROS多，但是flg22+地塞米松联合处理后，第二阶段产生的ROS超级多。那flg22+地塞米松诱导激发的ROS是不是被flg22激发的PTI的信号影响了呢？

为了解决上述这个疑问，作者先用flg22+地塞米松处理叶片，然后在第35分钟的时候用双蒸水洗掉溶液中的是flg22和地塞米松，然后再分别加入双蒸水、flg22、地塞米松及flg22+地塞米松。在第二阶段，双蒸水处理和地塞米松处理长生的ROS的量及持续时间差不多，这说明当flg22被冲洗掉以后。但是单独flg22激发的ROS和flg22+地塞米松激发的ROS的量及持续时间类似。这个结果表明ETI$^{ROS}$的产生需要flg22的加入才能完成。

除此之外，还利用突变体进行验证。在bbc突变体（没有PRR/共受体）中，flg22在第一阶段并没有激发ROS的爆发，而且也几乎没有ETI$^{ROS}$生成。

上述这些结果要说明啥呢？主要就是说明ETI$^{ROS}$的生成需要PRR/共受体的参与。为什么呢？我的理解是，如果ETI$^{ROS}$的生成不需要PRR/共受体的参与，那地塞米松单独的诱导就应该能够激发ETI$^{ROS}$的生成，但是呢并没有；反而flg22+地塞米松共同诱导时，ETI$^{ROS}$才大量生成爆发。

从上面这些结果，我能感受到的是，为了说明白一个现象，应该从多方面入手。首先要选择合适的材料，也就是要选择合适的突变体材料，不同的目的选择不同的材料。另外呢，不仅仅要从表型入手，还要从一定的衡量指标入手，比如ROS的爆发这个指标。

似乎，到这里就卡住了。要是我，到这里就完全卡住了。作者下一步是去探究PTI、ETI相关的ROS在胞内爆发的位置是不是同一个位置。

用荧光染料H$_2$DCFDA进行染色。发现D36E(avrRpt2)在侵染野生型植株5h后，在质外体空间有大量的ROS，在两个突变体中ROS的量都很少。这个结果就这样一句话。然后阐述的是两类酶：NADPH氧化酶和过氧化物酶。这类个酶有啥用呢？这两类酶参与了病原相关质外体ROS生成。然后呢是探究这两类酶中的哪一类和ETI$^{ROS}$的生成相关。

怎么验证呢？那当然是使用化学抑制剂。选用的化学抑制剂是NADPH氧化酶抑制剂DPI（二苯基碘），过氧化物酶抑制剂SHAM（水杨基氧肟酸）和叠氮化钠（$NaN_3$）。从下图a看可以看出的是，DPI处理后第二阶段ROS的爆发显著减少，几乎没有。

为了进一步确认DPI抑制了第二阶段ROS的爆发，在前处理的第40分钟加入这三个抑制剂。为什么要选择第40分钟呢？因为这个时间点刚好在PTI$^{ROS}$之后，在ETI$^{ROS}$之前。同样只有DPI处理后第二阶段的ROS爆发才被明显抑制。这两个结果就说明ETI$^{ROS}$是由NADPH氧化酶介导的。

NADPH氧化酶不止一种，那研究哪种呢？在这个研究中选择的是RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOGUE D（RBOHD，呼吸爆发氧化酶同系物D）。D36E(avrRpt2)能够引起野生型植株质外体空间大量的ROS爆发，但是在rbohd突变体植株中几乎没有ROS的爆发。作者再找个地方的结论是RBOHD是连接PTI和ETI的关键分子节点。

先梳理下前面的思路和流程。先是通过比较细菌的量发现ETI成功激活需要PRR/核心受体的参与。再用只能激发PTI的菌D36E和能够激发PTI+ETI的菌D36E(avrRpt2)，以野生型和突变体（没有PRR/共受体）为寄主材料，进一步探究细菌的菌量，在再一次验证的基础上又对ROS进行衡量，在确定ETI$^{ROS}$的爆发需要PTI信号参与后，再对影响ETI$^{ROS}$的酶进行探究（PS：个人觉得从这里开始就是机制探究了，前面的都属于“表型”确证）。探究的方法是通过使用化学抑制剂。通过化学抑制剂发现NADPH氧化酶是影响的ETI$^{ROS}$的关键酶，NADPH酶不止一个，那先哪个呢？作者选的是RBOHD这个酶（我猜他们做了很多酶，发现这个还好，就选这个进行后续的验证）。

既然发现RBOHD是连接PTI和ETI的关键节点，那就应该对RBOHD进行更深入的研究。管它呢，转录组先安排上😂。从转录组（下图d）可以看到的是，野生型植株在被D36E和D36E(avrRpt2)侵染后，RBOHD的表达量都比CK的提高了，但是呢D36E(avrRpt2)侵染后RBOHD表达量更高。我们可以看到的是，在突变体bbc中，D36E几乎没有诱导RBOHD的表达，但是D36E(avrRpt2)侵染后，bbc这个突变体中RBOHD的表达量显著增强。这个地方就有点奇怪了。按理说在野生型植株中，D36E(avrRpt2)能够激发PTI+ETI，RBOHD的表达量确实会很高。但是在bbc突变体植株中，是没有PRR/共受体的，也就是没有PTI的发生的，但是RBOHD的表达量却比野生型的还高。作者从这个地方看出来的是在ETI过程中，PRR信号会导致RBOHD出现翻译后调控（修饰）。到这个地方这个结果就没有更多的解释了。下一步作者谈到的是ROS产生的过程中CPKs和BIK1等激酶会参与磷酸化RBOHD（PS：我觉得，蛋白质翻译后修饰的方式有很多种，磷酸化是最常见的，因此关注磷酸化）。

下一步呢就对这两个激酶的功能进行验证，看看是谁在磷酸化RBOHD，从而影响ROS的合成。还是利用突变体进行染色，发现在突变体bik1中，ROS的生成明显减少，但是在cpk的突变体中ROS的生成和野生型差不多（下图）。

在确定是BIK1在起作用后，就去看看在PTI和ETI的过程中，RBOHD磷酸化水平是不是有差异（下图）。可以看到的是，在野生型植株中，单独的地塞米松能够引起RNOHD轻微的磷酸化，flg22+地塞米松会引起RBOHD更强烈的磷酸化。但是在bbc突变体中没有观察到磷酸化。这也就说明PTI信号对RBOHD的磷酸化是重要的。bbc突变体没有PRR/共受体，那也就不能产生PTI信号，没有PTI信号刺激，没有发生磷酸化，那也就是说PTI信号影响RBOHD的磷酸化。如果RBOHD的磷酸化不需要PTI信号，那在bbc突变体中，地塞米松或者flg22+地塞米松处理下应该能够看到RBOHD的磷酸化。这个结果再次说明ETI过程中RBOHD磷酸化的发生需要PRR/共受体的参与才能完成。

除此之外呢，还发现RBOHD的磷酸化需要BIK1的参与才能完成（下图）。

从上面这几个结果得到一个结论：PTI和ETI都在影响RBOHD生成ROS，其中NLR信号影响了RBOHD的丰度，PRR-BIK1信号影响了RBOHD的全活性。其实也就是ETI信号影响RBOHD的多少，而PTI信号+ETI信号则影响着RBOHD的功能。

RBOHD的激活需要PTI信号，而且在ETI期间，RBOHD的表达有限制的提高，这是不是意味着ETI不仅仅选择PTI通路中的某些成分作为其机制，还选择RBOHD作为其机制呢？说简单点就是ETI的过程中是不是PTI成分和RBOHD都参与了呢？

怎么解决上面这个问题呢？还是转录组！

从上图c可以看到的是，在D36E(avrRpt2)侵染后3小时，就已经有大量的基因的转录表达发生了变化。怎么看呢？D36E侵染后3小时，只有3820个基因发生变化；D36E(avrRpt2)侵染后3小时，有7967个基因发生变化。这也就说明3个小时内，c的效应子AvrRpt2就能够进入信号内激发ETI。值得注意的是，不管是在野生型还是突变体中，D36E(avrRpt2)侵染后，差异基因的表达模式类似（下图d最右边）。这个就很奇怪了啊，在bbc突变体中，按理说是没有PTI响应的，只有ETI，那PTI相关的那部分基因的表达就应该有表现出差异，但是并没有，反而是和ETI相关的基因的表达模式类似。这说明啥呢？这表明ETI在被激发后，能够重新影响PTI相关基因的全局表达。水杨酸、茉莉酸及乙烯相关的差异基因的表达模式也类似（下图e-g）。

在这些差异基因中，从bbc这个突变体被D36E(avrRpt2)侵染后有272个差异基因。其中一些WRKY相关的基因表达下调，还有一个基因—FRK1（flg22激发的PTI过程中冠菌素的marker基因）的表达也下调（下图）了。这个结果能说明啥呢？说明WRKY-FRK1是免疫系统中一个独立的分支。