Nature文章的NLR分析方法

《Nature》论文NLR基因分析方法深度解析

核心目标

本研究的核心生物信息学目标是，在52个马铃薯基因组（代表Solanum section Petota）中，进行全面且高度精确的NLR基因重新注释，构建一个综合性的“NLRome”，并基于此进行深入的比较基因组学和进化分析，最终指导功能基因的克隆和抗性工程。

---

分析模块一：NLR基因的重新注释 (Reannotation of Nucleotide-binding Resistance Genes)

分析目的：
解决NLR基因因聚集分布（gene clusters）和高序列相似性导致的常规注释不准确问题。此流程旨在对特定基因组区域进行精细化的基因预测，以获得高质量的NLR基因模型。

1. 筛选包含NLR的基因组区域

• 方法/软件: NLR-Annotator (v.0.7)
• 参数: 默认参数 (default parameters)
• 输入:
  • 基因组序列文件 (genome.fasta)
• 输出:
  • 一个GFF3文件，标记了所有推定的NLR基因及其保守基序的位置。
• 注意事项:
  • 此步骤是一个初步筛选，目的是缩小后续精细注释的范围，提高效率和准确性。
  • 原文指出，NLR-Annotator 倾向于漏掉RNL (RPW8–NB-ARC–LRR) 亚家族的NLRs，这是一个已知的软件局限性，需要在后续步骤中手动弥补。

2. 准备精细注释的输入证据

• 目的: 为核心注释工具 MAKER 提供三种不同类型的证据，以确保预测的准确性。
• 输入准备:
  • 基因组片段:
    1. 从第一步 NLR-Annotator 输出的GFF3文件中提取坐标。
    2. 在每个坐标的左右两侧各延伸2 kb (2-kb left and right flanking sequences)。
    3. 使用bedtools getfasta或类似工具，从全基因组中提取这些加长后的片段序列。
  • 同源蛋白证据 (Homology Evidence):
    1. 构建一个非冗余的NLR蛋白同源数据库。来源包括：
       • 先前研究中获得的7,007个氨基酸序列。
       • 拟南芥（Arabidopsis）的所有已知NLR基因（Araport11注释版本）。
       • 实验验证过的NLR基因数据库：PRGdb 3.0 和 RefPlantNLR。
    2. 将以上所有蛋白序列合并成一个FASTA文件。
  • 从头预测证据 (De Novo Gene Prediction):
    1. MAKER需要物种特异性的训练集。这些训练集来自于全基因组注释流程中为SNAP, AUGUSTUS, GeneMark-ET准备的模型。
  • 表达证据 (Expression Evidence):
    1. 使用全基因组的RNA-seq数据组装出的转录本序列 (assembled transcripts)。

3. 使用MAKER进行NLR基因模型注释

• 方法/软件: MAKER
• 输入:
  • 上述准备好的基因组片段、同源蛋白证据、从头预测证据和表达证据。
• 输出:
  • 一个GFF3文件，包含了在输入片段上预测出的NLR基因的精确结构（外显子、内含子等）。
  • 对应的蛋白质序列和CDS序列FASTA文件。
• 注意事项:
  • 这一步是整个注释流程的核心，通过整合多源证据，MAKER能够比常规注释流程更准确地界定NLR基因的边界和结构。

4. NLR基因的分类

• 方法/软件: NLRtracker (v.1.01)
• 输入:
  • MAKER输出的NLR蛋白质序列文件。
• 输出:
  • 一个分类结果文件，将每个NLR基因根据其结构域（TIR, CC, NB-ARC, LRR）分为三大类和八个亚类。
    • 主要类别: TIR-NLR (TNL), CNL, NL
    • 次要类别: CNL, CN, CCX, TIR-NLR (TNL), TN, TX, NL, NBS

5. 手动补全RNL亚家族

• 目的: 修正NLR-Annotator的系统性偏差。
• 方法:
  1. 在全基因组的蛋白质预测结果（而非仅在MAKER注释的NLR区域）中，通过关键词搜索或结构域鉴定（如HMMER搜索RPW8结构域）来识别RNL基因。
  2. 将手动识别出的RNL基因整合 (manually integrated) 到NLR-annotator-based的NLR预测集中。
• 注意事项:
  • 这一步是确保NLRome完整性的关键补充。

6. 最终整合

• 方法: 将最终得到的、高质量的NLR基因注释结果，整合回原始的全基因组基因注释文件中。

---

分析模块二：NLRome的构建与分析 (Construction and Analyses of the NLRome)

分析目的:
基于高质量的NLR注释，构建一个系统发育框架，对所有NLR基因进行分类、聚类，并研究它们的进化动态。

1. 构建NLR系统发育树

• 方法/软件:
  • 序列提取: 使用HMMER (v.3.3.2) 提取所有NLR蛋白的NB-ARC结构域氨基酸序列，E-value阈值设为0.001。
  • 多序列比对: MAFFT (v.7.490) 使用--auto参数。
  • 建树: RAxML (v.8.2.12)
    • 参数: -f a -x 5 -p 5 -# 100 -m PROTGAMMAJTT
    • Bootstrap: 100次。
    • 模型: 使用IQ-TREE (v.2.0.6) 的-m MF参数选择最佳氨基酸替换模型，结果为JTT模型。
• 输入:
  • 所有预测出的NLR蛋白序列。
• 输出:
  • 一个基于NB-ARC结构域的最大似然法系统发育树。

2. NLRome的聚类与分类

• 方法:
  1. 手动聚类: 基于上述构建的系统发育树，手动将所有NLRs划分为489个clade。划分标准是“一个clade内的成员共享一个共同的祖先”。
  2. 超级家族分类: 依据系统发育树中的位置以及已报道的NLRs，将所有clade进一步归入6个超级家族 (super clades): RNLs, TIR-NLRs, CCG10-NLRs, CC-NLR-others, CC-NRC-helpers, CC-NRC-sensors。
  3. Clade类型定义: 根据一个clade内最主要的NLR类型（CNL, TNL等），为该clade指定类型。
  4. 识别成对/成簇的NLRs: 如果一个clade中超过50%的成员是成对或成簇排列的，则该clade被定义为paired或clustered clade。

3. 区分Type I 和 Type II NLRs

• 方法:
  • 依据先前研究的标准（Kuang et al., 2004），基于系统发育树的分支长度 (branch length) 和物种间的等位/直系同源关系 (allelic/orthologous relationships) 来区分。
  • Type I: 分支长，拷贝数变化大，物种间呈旁系同源关系。
  • Type II: 分支短，拷贝数稳定，物种间呈直系同源关系。

---

分析模块三：非经典结构域(ID)的鉴定与进化分析

分析目的:
在NLRome中鉴定所有携带非经典整合结构域（Integrated Domains, IDs）的NLRs，并研究这些ID的进化起源和选择压力。

1. ID的鉴定

• 方法/软件:
  • 使用pfam_scan.pl脚本对所有NLR蛋白进行结构域预测。
  • 过滤掉已知的NLR经典结构域（如NB-ARC, LRR, TIR, CC, RPW8等）。
  • E-value阈值设为0.05。
  • 为避免注释错误，排除了那些只在一个NLR和一个物种中出现的ID。
• 输出:
  • 一个包含所有ID-NLRs及其携带的非经典结构域的列表。

2. 进化压力分析 (Ka/Ks 和 Tajima’s D)

• 目的: 比较ID在NLR基因和非NLR基因中的进化选择压力。
• 方法/软件:
  • 序列比对: MAFFT进行密码子比对 (ParaAT v.2.0)。
  • Ka/Ks计算: PAML (v.4.9) 中的codeml程序，使用one model。
  • Tajima’s D计算: VCFtools (v.0.1.16) 使用--TajimaD 1参数。
• 输入:
  • NLR和非NLR基因中相同ID的编码序列。
• 注意事项:
  • 该分析要求一个ID在至少四个物种中存在，以保证统计的稳健性。
  • 更高的Ka/Ks值和更低的Tajima’s D值通常表明受到了更强的正选择或更弱的纯化选择。

---

通过以上三个模块的系统性分析，该研究构建了一个高质量的马铃薯NLRome，并从中获得了关于NLR进化、功能分化以及抗性工程的重要洞见。这套流程为其他物种的NLR基因研究提供了极佳的范本。