DNA甲基化数据分析流程

参考文献

Wilkinson S W, Hannan Parker A, Muench A, et al. Long-lasting memory of jasmonic acid-dependent immunity requires DNA demethylation and ARGONAUTE1[J]. Nature Plants, 2023: 1-15.

原始数据：点击查看

参考基因组

Ensembl Plants TAIR10.55

软件安装

• Bismark

mamba install -c bioconda bismark

• Bowtie2

wget -c https://nchc.dl.sourceforge.net/project/bowtie-bio/bowtie2/2.5.1/bowtie2-2.5.1-linux-x86_64.zip
unzip bowtie2-2.5.1-linux-x86_64.zip
cd bowtie2-2.5.1-linux-x86_64
make

基因组准备

甲基化的C在Bisulfite处理后不会发生变化；未发生甲基化的C在处理后会变为U，PCR扩增后会变为T. 因此甲基化比对时需要特定的基因组，所以需要对基因组进行转换：C->T 和 G->A.

DNA甲基化比对使用最广泛的比对软件是Bowtie2，因此选择Bowtie2作为比对器（不同的比对软件需要不同的index文件）：

bismark_genome_preparation --path_to_aligner ~/mambaforge/envs/tools4bioinf/bin/ --bowtie2 --parallel 60 --verbose data/genome 

完成转换后会在基因组数据路径下生成新的文件，分别是C->T 和 G->A的转换版：

./data/genome
├── Bisulfite_Genome
│   ├── CT_conversion
│   │   ├── BS_CT.1.bt2
│   │   ├── BS_CT.2.bt2
│   │   ├── BS_CT.3.bt2
│   │   ├── BS_CT.4.bt2
│   │   ├── BS_CT.rev.1.bt2
│   │   ├── BS_CT.rev.2.bt2
│   │   └── genome_mfa.CT_conversion.fa
│   └── GA_conversion
│       ├── BS_GA.1.bt2
│       ├── BS_GA.2.bt2
│       ├── BS_GA.3.bt2
│       ├── BS_GA.4.bt2
│       ├── BS_GA.rev.1.bt2
│       ├── BS_GA.rev.2.bt2
│       └── genome_mfa.GA_conversion.fa
├── genome.fa
└── genome.gff3

3 directories, 16 files

比对

bismark -p 60 --bowtie2 --genome ./data/genome/ -1 ./data/fastq/SRR18508333_1.fastq.gz -2 ./data/fastq/SRR18508333_2.fastq.gz -o ./results/2.mapping

去重

deduplicate_bismark --bam results/2.mapping/SRR18508333_1_bismark_bt2_pe.bam  

甲基化提取

bismark_methylation_extractor --gzip --bedGraph results/2.mapping/SRR18508333_1_bismark_bt2_pe.deduplicated.bam -o results/2.mapping