新希望—野生（近缘）种质资源

种质资源是极其重要的资源，随着世界人口的增加，对粮食产量的要求越来越高，包括产量和质量。但是，作物生长会受到各种各样的胁迫，包括生物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫主要是病原侵染和昆虫取食；非生物胁迫包括干旱胁迫、盐胁迫、重金属胁迫等。应对病原菌侵染胁迫常见的方法是使用抗病品种和使用化学农药，但是这两种方法都有一定的局限性：

种植几年后，抗病品种携带的抗性基因的抗性会逐渐丧失；
光谱抗性基因通常会影响作物的产量和质量等性状；
抗性基因叠加较为困难；
化学农药的滥用会带来一系列的问题，如食品安全、环境污染等。

虽然这些问题都有一定的解决办法，如在化学农药的研发中利用RNAi技术。各种组学技术的发展极大地促进了作物抗性基因的挖掘和利用。“绿色革命”以后，大量的品种被培育推广，这些单一品种的大面积推广种植导致其可利用的抗性基因数量逐渐减少。而那些未被大面积推广，甚至是没有被发现利用的品种则成为了关键基因挖掘利用的关键材料，如中科院遗传发育所的储成才研究员利用100余个农家品种成功挖掘到水稻氮素高效利用的关键基因$^{[1]}$。除开这种利用未被发掘的种质资源外，一个比较新的方向是利用野生/近缘种植资源挖掘关键的遗传资源。最近最经典的案例是遗传发育所的李家洋院士利用四倍体野生稻直接实现了野生到的从头驯化，利用十余年的研究就实现了需要几千年才能完成的自然驯化，开辟了育种的新方向$^{[2]}$。这两天，塞恩斯伯里实验室在Nature Plants上发表了一篇文章，在茄属种植物中发现并成功克隆了新的对马铃薯晚疫病具有光谱抗性的基因$^{[3]}$。大年初一下载了文献，通读一遍，简直就是精彩啊！

文献心得

读完这篇文献，感触良多，总结几点：

实验室（课题组）的前期研究（传承）很重要，在某个领域的点滴积累是发现新方向新东西的重要基础，研究要利用课题组优势；
野生（近缘）种质资源是非常重要的资源，保护、开发、利用这些种质资源对未来社会具有重要影响；
技术的发展能够极大地促进科学研究的发展，这个研究中利用了许多技术，如RenSeq、GenSeq、单分子实时测序、关联基因组学等技术，需要不断地学习才能了解技术的发展方向并合理地利用这些技术；
合理的可视化方法能够极大地增强文章的可读性，倒数第二张图片直接是让我拍案叫绝啊，学习了；
推理能力很重要，作者从进化树上推理出基因（蛋白）之间的依赖关系，这种推理能力的基础是大量的文献阅读，没有大量的知识储备是不可能完成这种推理的。

马铃薯晚疫病

马铃薯晚疫病（potato late blight，PLB）是由致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont) deBary，P. infestans]引起的。严重时会造成50%的损失，某些地区甚至会绝收$^{[4]}$。下图是致病疫霉侵染马铃薯的症状图$^{[5]}$。

本研究简述

研究人员从茄属植物中克隆到了许多抗性基因，并通过育种的方法将这些抗性基因导入到马铃薯中。但是，单个的抗性基因在面对进化速度较快的致病疫霉P.infestans时，抗性会丢失，因此需要挖掘利用具有持久抗性的基因。研究人员从光果龙葵中克隆到了一个抗性基因：Rpi-amr1。利用来自不同国家的19个致病疫霉进行侵染测试，发现这个基因对19个致病疫霉都具有抗性。进一步利用关联基因组学和长读长RenSeq技术，研究人员又在其他的光果龙葵中及其近缘种中发现了8个Rpi-amr1的等位基因。尽管这些等位基因的蛋白序列与Rpi-amr1的蛋白序列只有90%左右的相似性，但是它们对致病疫霉均具有光谱抗性，但是对Avramr1的直系同源物和旁系同源物的识别能力不一样。这个研究为挖掘对P.infestans 具有抗性的基因提供了新的思路。

研究过程

研究团队在之前就在光果龙葵中鉴定到了对P.infestans 具有抗性的基因Rpi-amr3，未来挖掘到新的Rpi-amr基因，团队利用14个对P.infestans 具有抗性的光果龙葵品系及其近缘植物S. nigrescens 和 S. nodiflorum来构建F1和F2群体。利用RenSeq得到的marker，借助基因分型测序（GBS）和全基因组鸟枪测序（WGS）在11号染色体的短臂上定位到了基因Rpi-amr1。进一步利用单分子测序技术发现有11个潜在的编码序列，其中9个编码NLR基因。为了验证这些基因是不是都可以表达，利用cDNA RenSeq数据比对发现其中有7个基因都发生了表达，分别是Rpi-amr1a到Rpi-amr1h（下图a-c）。

找到那么多个潜在的功能基因，那是不是都有功能呢？通过接种发现只有Rpi-amr1e这个能够减缓P.infestans的生长（下图）。

那这个Rpi-amr1e对P.infestans到底有没有抗性呢？直接将这个基因克隆到马铃薯中，同时以没有功能的Rpi-amr1a作为阴性对照。发现克隆了Rpi-amr1e的马铃薯对P.infestans的抗性简直完美啊（下图）。

这个基因结构是啥样的呢？研究者将cDNA RenSeq数据mapping到Rpi-amr1的全长数据上，发现有4种可变剪切结构（下图）。这个基因是典型的CC-NB-LRR抗性基因，具有CC、NB和LRRs结构域，这三种结构域都在第一个外显子上。剩下的三个外显子上没有发现已知结构域的同系物。

在之前的研究中他们发现14个光果龙葵极其近缘种对马铃薯晚疫病都有抗性，为了验证Rpi-amr1是不是也能赋予了其他光果龙葵抗性，研究人员从亲本为抗性品系的F2群体中选择了10-50株感病植株进行验证，在Rpi-amr1位置上挑选了个marker。结果发现这些干饼F2植株都缺少这个marker，这个个结果就表明光果龙葵对致病疫霉的抗性是由Rpi-amr1 locus赋予的。那对致病疫霉具有抗性的光果龙葵的抗性是不是由Rpi-amr1的同系物赋予的呢？为了验证这个猜想，研究者利用SMRT RenSeq从头组装了那些抗性品系，以此来寻找Rpi-amr1的同系物，此外还利用了BSA RenSeq、cDNA RenSeq、关联基因组学和GenSeq等技术，最终找到8个Rpi-amr1同系物对88069这个菌株具有抗性。

找到了功能基因及其同系物，下一步那就应该看看它们对致病疫霉的抗性能力怎么样了。研究者挑选了两个同系物，Rpi-amr1-2272和Rpi-amr1-2273，用于测试的19个菌株来自不同国家。结果发现转入这两种同系物的马铃薯对这19株致病疫霉均有抗性，而野生型的马铃薯对这19株菌都没有抗性。这个结果表明Rpi-amr1对致病疫霉P.infestans具有广谱抗性。

植物免疫响应的重要组成部分之一是ETI，那Rpi-amr1及其同系物能不能有效识别到致病疫霉P.infestans中的效应子呢？为此，研究人员合成了Avramr1及其3个同系物，这三个同系物与Avramr1在进化树上属于不同的分支（分别属于Clade A-D）。除此之外，还从P.parasitica和P.cactorum中也合成了Avaamr1的同系物。

结果发现Rpi-amr1不同的等位基因与不同的Avramr1同系物组合时，产生的免疫反应不一样（下图）。从图中可以看出的是，Rpi-amr1的功能性同系物至少能够识别一种Avramr1。

Rpi-amr1介导的抗性和效应子识别是它自己独立完成的呢还是需要依赖于其他成分呢？研究者首先对茄科植物代表性的NLR蛋白构建进化树，发现Rpi-amr1分组在CNL-3这个分支中，这个分支中之前没有克隆到任何的功能基因。与之最近的已被克隆到的基因是属于CNL-13这个分支位于4号染色体上的Rpi-amr3，这个基因与Rpi-amr1在氨基酸序列上具有31.2%的相似性。通过进化树研究人员猜测Rpi-amr1很可能需要NRC分支的帮助才能完成其功能。这个是怎么看出来的呢？作者解释的是CNL-3这个分支所在的分组（蓝色框）需要依赖于NRC才能完成相应的功能。利用瞬时表达发现Rpi-amr1介导的抗性需要NRC2或者NRC3的帮助才能完成。更多的研究结果进一步说明了Rpi-amr1介导的抗性和效应子识别需要依赖NRC2或者NRC3才能完成。

似乎，研究到这里就应该结束了。但是还探究了Rpi-amr1同系物是否存在于其他的茄科植物中。进一步的研究发现在六倍体茄科植物S.nigrum中也存在Rpi-amr1的同系物。

还有一个问题：Rpi-amr1有那么多的等位基因，是怎么来的呢？研究人员进一步研究发现是由于直系同源和旁系同源间序列交换才形成了如此高的等位基因多样性。

参考文献

Liu Y, Wang H, Jiang Z, et al. Genomic basis of geographical adaptation to soil nitrogen in rice[J]. Nature, 2021: 1-6.

Yu H, Lin T, Meng X, et al. A route to de novo domestication of wild allotetraploid rice[J]. Cell, 2021.

Witek, K., Lin, X., Karki, H.S. et al. A complex resistance locus in Solanum americanum recognizes a conserved Phytophthora effector. Nature Plants (2021).

赵中华,朱杰华,朱晓明.马铃薯晚疫病发生特点与防治对策[J].中国植保导刊,2012,32(04):16-17.

祝菊澧,梁静思,王伟伟,王洪洋,刘晶,李灿辉,唐唯.马铃薯致病疫霉研究进展[J].微生物学通报,2020,47(03):952-966.