PTI中的信号网络
摘要
在自然环境下,植物时时刻刻都在面对病原物的入侵。然而,由于植物具有有效的免疫系统,植物病害很少发生。病原物被两层不同的识别系统识别:PTI和ETI。PTI和ETI都具有能够阻止病原入侵的诱导防御系统。本综述主要讨论PTI中的信号通路网络,主要聚焦于丝裂原活化蛋白激酶。
Introduction
植物能够将光变成糖类,因此植物成为了包括微生物(尤其是以植物地上地下部分为寄主的微生物)在内的大量生物的碳水源和能量来源。植物病原物根据其侵染方式和取食策略,可以分成活体营养型(如Hyaloperonospora arabidopsidis)、半活体营养型(如Pseudomonas syringae)和死体营养型(如Botrytis cinerea)。植物病原物能够降低植物的生物量、降低植物的育性、影响作物的产量和质量,甚至在是杀死植物,从而引起人们的关注。
植物通常能够抵御大多数病原物的侵染,这种现象叫非寄主抗性(non-host resistance)。表皮和细胞壁是植物抵御病原菌侵染的第一层物理屏障。除开第一层物理屏障外,植物持续分泌的抗菌物质也能有效的抵御病原菌的侵染。陆生植物最外层都有由角质和蜡质组成的表皮。表皮在植物生理上有着重要的作用,如较少水分散失、抗UV辐射等。表皮同样能够有效抵御植物病原菌侵染和昆虫的取食(真菌能够通过机械压力来穿透表皮或者是通过分泌能够水解角质聚酯的角质来透过表皮)。此外,包裹在植物细胞周围的外骨骼——植物细胞壁,由纤维素微纤维、果胶、半纤维素、蛋白质及木质素等组成。细胞壁在完整性维护机制的控制下给细胞提供了结构支撑的同时能够有效应对(非)生物胁迫。某些真菌能够穿透表皮和细胞壁,但是细菌不能直接地穿透植物表皮。细菌需要借助一些自然孔口才能进入植物体内,这些自然孔口包括the hydathodes, the nectarthodes, the lenticels,最重要的孔口是气孔。此外,昆虫取食、食草动物、风、暴雨等造成的植物伤口也是病原物侵染植物的有效途径。除了利用物理屏障抵御病原菌的侵染外,植物还能持续稳定地合成并分泌抗菌物质来抑制病原菌的生长。一些代谢物和蛋白都具有这种抗菌活性,如十字花科植物的此生代谢产物芥子油甘及其衍生物。那些成功穿过植物物理屏障的病原物在进入植物细胞后需要卖你对的是植物的免疫系统。植物的免疫系统包括了两部分:病原物识别和病原物防御。
植物免疫系统的第一层是PAMPs(病原相关分子模式)/PRRs(病原/模式识别受体)。PAMPs通常也来自非致病菌,因此它们被优先命名成MAMPs(微生物相关分子模式)。植物识别到MAMPs后会诱导PAMP激发的免疫,或者是诱导病原激活的免疫或者是模式激发的免疫,也就是PTI。植物同样能够感知到损伤相关的分子模式(DAMPs),这些DAMPs是植物在遭受病原菌侵染后降解的产物。DAMPs激发的免疫和响应和PTI响应类似。植物也可以通过感知病原物效应子(病原物合成后释放到植物的胞外空间或胞内来增强病原物的适应性)来感知病原的入侵。 不能正常感知到这些效应子的植物对该病原菌表现为感病,从而导致由效应子激发的易感性;而能够通过R蛋白来识别这些效应子的植物则会激发ETI。植物和病原在共进化的过程中形成了Z型模型。

在成功识别病原物后,植物会启动一系列的防御机制,如关闭气孔阻止细菌的进入、控制营养物质从细胞质到质外体的转运来限制细菌的增殖、合成并分泌camalexin等植保素、合成分泌PR1等防御相关的蛋白或多肽、在被侵染部位合成与过敏反应相关的活性氧(ROS)。
病原识别机制中涉及到了复杂的信号网络。本篇综述重点关注的是PTI过程中的信号网络及丝裂原活化蛋白激酶(MAMPs)参与途径。主要以拟南芥-细菌互作系统进行描述。
MAMP/DAMP识别
植物能够识别对微生物很重要的MAMPs。MAMPs包括蛋白(如细菌鞭毛蛋白和延伸因子Tu)、碳水化合物(如真菌的几丁质)及脂多糖等。DAMPs是病原菌侵染过程中植物的降解产物(如角质素单体)、细胞壁受损产物或者AtPep1等内源肽。PRRs通常是质膜结合类受体激酶(RLKs)或者是有着胞外结构域的类受体蛋白。已经鉴定到了一些PRR/DAMP对,如拟南芥中能够识别细菌鞭毛(铜绿假单胞菌的22个氨基酸长的抗原决定簇flg22为代表)的N端的flagellin-sensitive 2(FLS2)(图2)、拟南芥中的EF-Tu受体(EFR)。在DAMPs中,RLK蛋白PERR1是DAMP AtPep1的受体。

此外,一些蛋白与PRRs组成了免疫受体复合物,而且这些蛋白对正常的MAMP识别和信号转导是至关重要的。MAMP感知不仅能够快速(几秒)诱导质膜上免疫受体复合物的形成,还能诱导不同的自磷酸化和反磷酸化。和BRI1相关的受体激酶1(BAK1)能够和FLS2互作,BAK1缺失会导致早期依赖flg22响应的下降。BAK1实际上可以与不同的PRR相互作用,并与FLS2互作结合flg22,因此可以被看成共受体。除了BAK1外,受体样胞质激酶葡萄孢菌诱导的激酶1(BIK1)和相关的PBL激酶能够与FLS2及EFR互作,在MAMP结合后迅速被磷酸化并从PRR复合物中释放。
Ca$^{2+}$爆发
植物在感知到MAMP/DAMP后,最早的物理响应之一就是胞外Ca$^{2+}$的内流,发生的时间在0.5-2min,4-6min达到峰值。BIK1以及其他BIK1家族蛋白正向调控Ca$^{2+}$的内流。Ca$^{2+}$的内流导致H$^{+}$内流、K$^{+}$和NO$_3^{+}$外流,从而使得胞外空间碱化(1min左右)及质膜去极化(1-3min)。正常情况下,细胞质中Ca$^{2+}$的浓度受质膜和膜内Ca$^{2+}$通道调节;但是涉及到MAMP/DAMP识别和信号转导相关的分子物质还尚不清楚。值得注意的是,在MAMP响应中,拟南芥脂膜上的能与FLS2及ACA8互作的拟南芥自抑制Ca$^{2+}$ATP激酶8和其同系物ACA10参与了Ca$^{2+}$水平调节。MAMP识别过程中除了Ca$^{2+}$会快速流入细胞质外,Nomura等发现在叶绿体基质中自由Ca$^{2+}$水平会持续更长时间。研究人员还观察到使用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和MAPK激酶抑制剂可减少细胞质和间质Ca$^{2+}$的浓度变化,说明MAPK在Ca$^{2+}$信号的产生过程中可能有着相关的级联反应。考虑到MAMP/DAMP识别中质外体快算碱化,很可能质膜上H$^{+}$-ATP酶的抑制也影响着阴离子外流和质子内流。
ROS爆发
由MAMP时,2-3min后胞外空间通常会发生活性氧爆发并在10-14min达到峰值。在拟南芥中,质膜上的NADPH氧化酶RBOHD和MAMP诱导的ROS爆发相关。有趣的是,P. syringae在拟南芥中引起的ROS爆发水平受到FLS PRR的调控,而且要在20min左右才能检测到ROS,在35-40min才达到峰值。波动的幅度也比flg22诱导的低。这些数据表明,鞭毛蛋白是在感染后80分钟内检测到的主要MAMP/DAMP,鞭毛蛋白的数量和/或可及性相对较弱。在MAMP感知中,RBOHD可以和FLS2及EFR关联,完全激活NADPH氧化酶需要Ca$^{2+}$诱导的钙依赖性蛋白激酶(CDPK)和BIK1对不同残基进行磷酸化。Ca$^{2+}$本身也能调控RBOHD。RBOHD能在质外体中产生不透膜的超氧化物O$_2^-$,该物质能够通过超氧化物歧化酶催化后变成H$_2$O$_2$。H$_2$O$_2$具有膜透性,从而能够进入到细胞质和不同的器官中。H$_2$O$_2$等活性氧也会影响胞内Ca$^{2+}$水平。MAMP/DAMP诱导的活性氧爆发对胞内Ca$^{2+}$水平有正反馈调节作用,从而导致二次峰值(flg22诱导后5min左右)。有趣的是,依赖于CDPK的RBOHD的磷酸化在ROS的刺激下也会发生。依赖MPK3/MPK6的MAMP/DAMP诱导的ROS爆发有着矛盾的结果。如,Zhang等发现细菌效应子HopAI1(能够使MPK3和MPK6失活)的诱导表达完全抑制了flg22诱导的ROS爆发,这个结果表明MPK3/MPK6作用在ROS爆发的上游。但是这种方法不能区分每个MAPK的特定贡献。后面又发现HopAI1还能抑制MPK4的活性。因为一些病原菌的效应子能够以不同的信号元件为靶标(如HopF2能够以多个MKKs和BAK1为靶标),因此HopAI1也有可能作用于位于ROS爆发上游的由flg22激发的信号的其他成分。Ranf等利用mpk的单突变体研究发现用flg22处理两个不同的mpk3突变体表现出更长时间的ROS爆发,mpk6突变体和野生型类似,所以MPK3负向调节由flg22诱导的ROS的爆发。Galletti等研究发现flg22诱导的ROS爆发在两个AP2C1(一个能够使MPK3和MPK6失活的MAPK磷酸化酶)过表达株系中没有受到影响,这个结果表明ROS爆发对于MPK3/MPK6来说是独立发生的。此外,他们也发现MPK4以AP2C1为靶标。最佳,Xu等发现mpk3与mpk6的双重突变体中ROS爆发与野生型类似,这表明ROS爆发与MPK3/MPK6无关。同样,由MAMP/DAMP诱导的依赖于MPK4的ROS爆发也有矛盾的结果。Zhang等发现flg22诱导的ROS爆发与MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4级联反应无关。然而,与野生型相比,MPK4株系中ROS爆发水平降低了,突变体mpk4中ROS爆发水平上调了,这表明MPK4负向调节ROS爆发。目前比较清楚的是,MAMP诱导的ROS爆发是由RBOHD引起的;其他RBOH蛋白参与了不同的信号通路。然而,NADPH氧化酶并不是植物细胞中唯一的ROS源;越来越清楚的是,植物中的ROS源(叶绿体、过氧化物酶、线粒体及质膜)有着复杂的时空变化,而且ROS其他信号之间也是及其复杂的。
其他小信号分子:RNO和脂类
除了Ca$^{2+}$和ROS外,MAMP信号中还有其他的小分子。被统称为活性氮的NO及其衍生物参与了信号转导的不同步骤,如通过半胱氨酸亚硝化调控PR genes 1(调控防御基因的表达)的非表达体的聚合状态,或者是通过半胱氨酸亚硝化抑制RBOHD。这些结果表明寄主在响应病原菌的过程中ROS和NO之间有着紧密的关系。NO在生成过程中有个滞后期,在此期间,隐球菌素和壳聚糖能够在几分钟内诱导NO的生成。壳聚糖能够持续诱导NO的生成(直到60min左右)。病原菌诱导的Ca$^{2+}$内流或激活钙调蛋白和/或类钙调蛋白,从而激活下游的NO合成。但是NO的生物合成还有很多不清楚的地方。
磷脂酸(PA)和神经酰类等脂类也被认为是植物响应病原物过程中的信号分子。在flg22或真菌的诱导子上,番茄细胞中PA会被快速诱导合成并在数分钟内达到峰值(对flg22来说是8min左右);与此同时,PA的前体物质PIP2和PIP的含量在2min开始降低,DGPP(PA的磷酸化产物)的含量开始升高。MAMP诱导的NO的合成部分需要PA参与才能完成,这个过程中涉及到两个通路:磷脂酶D(PLD)和磷脂酶C/二酰基甘油激酶(PLC/DGK)。PA可以与免疫信号转导的已知成分(如CDPKs、PDK1、RBOHD/F等)相互作用并调节其活性。外源PA能在几秒内诱导烟草细胞发生ROS爆发并在6min左右达到峰值;PA还能诱导已悬浮培养2min的大豆细胞中的MAPK。PA能从多个层面上调控信号转导,如ROS、MAPK活性、SA,还可能是ET。
异三聚体G蛋白
拟南芥有一个典型的G$\alpha$亚基(GPA1)、一个G$\beta$亚基(AGB1)和三个G$\gamma$基(AGG1、AGG2和AGG3)。和动物相反的是,植物的G蛋白独立于G蛋白偶联的受体,并且似乎是自我激活的。虽然GPA1没有参与到对P. syringae 的基础抗性中,对细胞死亡或MAMP诱导的MPK3/MPK6活性也没有明显的影响,但是AGB1、AGG1和AGG2却有着重要的作用。如,MAMP或P. syringae 诱导的ROS合成在agb1 突变体中就降低了。虽然agg1 和agg2 单突变体没有表现出明显的表型,但是它们的双重突变体对P. syringae 更敏感,并且成对的flg22/slf18及几丁质诱导的抗性也降低了。agb1 或agg1 agg2 中MPK3和MPK6的活性没有受到影响,但是MPK4的活性略微下降了一些。总之,这些结果表明除开GAP1外,AGB1、AGG1、AGG2都是MAMP诱导的免疫响应所需要的。这些G蛋白也部分参与了MAMP诱导的ROS爆发,但是MAMP诱导的MPK3、MPK4及MPK6的活性与G蛋白无关。AGB1-AGG1/2二连体是如何被RLKs激活的还尚不清楚。AGB1-AGG1/2二连体调控下游反应的精确通路也还不清楚。
14-3-3蛋白
14-3-3蛋白也参与了免疫信号转导。拟南芥中的14-3-3基因家族有15个成员,14-3-3蛋白通常与磷酸化蛋白互作来完善这些磷酸化蛋白的活性。在不同的植物中都有关于14-3-3蛋白但与抗病反应的研究报道,而且这些蛋白在这些抗病反应中通常具有正向调节作用。14-3-3蛋白能与免疫信号转导的已知成分互作并调节它们的活性,如玉米质膜上的H$^+$-ATP酶、NtRBOHD 、番茄中的MAPKKKalpha和MKK2、拟南芥因子CPK-1、PA、PDK1及一些参与ET生物合成的1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶。这些不同研究表明14-3-3既参与了PTI也参与了ETI。最近的一个研究阐述了14-3-3蛋白在PTI中的作用。利用5 -氨基咪唑- 4 -甲酰胺- 1 - b - D -呋喃核苷对14-3-3蛋白进行化学破胞后再与互作蛋白进行互作后发现再拟南芥和本氏烟中由MAMP诱导的ROS爆发明显降低了。P. syringae 的效应子HopM1会使14-3-3蛋白GRF/AtMIN10失稳。Lozano-Duran等的研究结果表明AICAR能够恢复不具有效应子HopM1的P. syringae 的毒力,这个结果进一步确定了14-3-3蛋白在免疫响应中的作用。也由研究发现本氏烟的同源物GFR8/AtMIN10在番茄敲除系中由MAMP诱导的ROS爆发降低了。目前为止的研究表明14-3-3蛋白能与磷酸化蛋白互作,参与到植物免疫信号转导的不同步骤,但是更多的具体的机制还有待研究。
蛋白激酶
由蛋白质激酶介导并由蛋白质磷酸酶清除的蛋白质磷酸化是真核生物中最常见的翻译后修饰,并且在信号转导中具有重要作用。蛋白质磷酸化会影响蛋白稳定性、酶活性及亚细胞定位等。在MAMP识别中发生着大量的磷酸化事件,磷酸化蛋白质组能够精确定位到磷酸化的位点。MAMP处理后磷酸化位点丰度降低表明磷酸化酶在PTI信号中有着及其重要的功能。
除开之前提到的在MAMP识别中除了免疫受体复合物会马上自磷酸化和反磷酸化外,其他的蛋白激酶也快速被激活。这些蛋白激酶大多数属于CDPK、MAPK及AGC蛋白激酶家族,它们也是调控转录因子、代谢酶、质膜蛋白及细胞骨架蛋白等大量蛋白靶标的关键。
CDPKs
拟南芥基因组编辑34个CDPKs。CDPKs有个N端丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域和一个C端类CaM结构域(EF-hand结合位点,大多数都要依赖于Ca$^{2+}$)。CPK4、CPK5、CPK6及CPK11等一些CDPKs会被flg22暂时(5-30min)地激活。P. syringae 侵染后,CPK4/5/6/11参与了由flg22介导的ROS爆发、flg22介导的转录重编程和flg22诱导的抗性。一些CDPK底物被鉴定到,如CPK5的第五RBOHD、番茄中CDPK2的底物ACS2。除了Ca$^{2+}$,CDPKs也会被其他参与信号转导的分子(如脂类、14-3-3蛋白)调控。
AGC及其相关激酶
AGC蛋白激酶参与了植物免疫响应并调控病原菌诱导的MAPK级联反应。在拟南芥中,AGC激酶家族有39个成员。通过H$_2$O$_2$、纤维素酶处理、抵御Hyaloperonospora arabidopsidis 和 P. syringae 侵染完全激活MPK3和MPK6需要AGC2-1(也叫OXI1)的参与才能完成。MAMPs和DAMPs(flg22、纤维素酶、H$_2$O$_2$)能够快速诱导根叶部OXI1的基因表达和酶活性。有趣的是,在RBOHD突变体或用NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘处理后,拟南芥中OXI1的转录诱导下降。MAMPs处理或半活体营养型病原菌侵染后的ROS爆发与RBOHD相关,这表明在植物-病原互作中RBOHD介导的XOI1诱导会导致ROS合成。OXI1调控一类蛋白激酶,如Pti1-1到Pti1-4。in vivo 发现受胁迫诱导的Pti1-4能与MPK6互作。对其他的AGC激酶来说,OXI1活性受到AGC激酶PDK1的调控,PA能以依赖PDK1的方式激活OXI1。然而,Pti1激酶活性在flg22和H$_2$O$_2$条件下不依赖于PDK1,但是依赖于OXI1,这个结果表明在受到ROS或MAMP刺激时其他蛋白激酶作用于OXI1的上游。
MAPKs
拟南芥基因组编码20个MAPKs、10个MAPKKs和60个MAPKKKs。MAPKKKs、MAPKKs和MAPKs都含有能够将胞外刺激转化成适当响应的功能信号模块。这些MAPKs在植物-病原互作研究中被广泛关注。flg22和其他MAMP处理后,MAPK3/4/6/11在1-2min内被激活并在10-15分钟达到峰值,之后迅速下降。MKK4/MKK5组成的信号模块通过磷酸化和MPK4上游的MEKK1-MKK1/MKK2激活MPK3/MPK6(图4)。最开始的研究认为MEKK1是MKK4/MKK5-MPK3/MPK6上游的MAPKKK。然而,在flg22处理后mekk1 突变体后,MPK3和MPK6被激活,这个结果表明MEKK1并不是这个模块上有的MAPKKK,或者至少一个其他MAPKKK扮演多余的角色。有意思的是,参与气孔发育及花序结构的MAPK模块由YODA下游的MKK4 / MKK5- MPK3 / MPK6组成,即MAPKKK。然而,由MAMP激发的MPK3和MPK6的活性在yoda 突变体中是正常的。免疫反应中MKK4/MKK5-MPK3/MPK6上游的MAPKKK(s)的鉴定还不清楚。MKK4/MKK5-MPK3/MPK6模块正向调节防御响应。mekk1突变体的MEKK1激酶受损后半矮化程度降低,这表明MEKK1在其酶活性之外还有个独立的结构性功能,但是仍然不能完全排除此MEKK1激酶受损版本具有残留活性。酵母双杂分析发现MEKK1直接与MPK4互作。然而,没有更多的数据来支撑这个结果。首先,MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4模块被认为会负向调控防御响应(级联模块突变体有着本构防御响应,如H$_2$O$_2$积累、PR基因的本构表达等,并且对病原菌的抗性增强了)。然而,最近的研究表明在mkk1 mkk2中这个MAPK模块实际上能够正向调节防御响应,而且被R 蛋白抑制子保护着。

PRR免疫复合物和下游的MAPKKKs之间的分子连接仍旧不清楚。一些数据表明flg22诱导的MPK3/4/6的活性部分依赖于Ca$^{2+}$爆发,但是在cpk5 cpk 6 cpk11 三重突变体中,flg22诱导的MPK3/4/6的活性并没有变化。在rbohd 突变体中flg22诱导的MPK3/4/6的活性和野生型类似,这说明ROS爆发不需要MAPK激活就能完成。此外,在bik1 pnl1 双重突变体中flg22诱导后MPK3/4/6的活性正常,这说明它们的激活不需要BIK1和PBL1就能完成;但是细菌AvrAC效应子表达的情况下flg22诱导的MAPK活性降低了,这表明额外的BIK1相关蛋白可能激活MAPK。此外,利用四重突变体研究发现flg22诱导的MPK3/MPK6激活与野生型是有差异的,这表明MAPK激活与SA、JA及ET信号通路是无关的。
MAPK 底物
当前在生物学中重要挑战是将给定的蛋白激酶与其真实的底物进行高度关联,尤其是在信号转导研究中。在PTI中,MAPK底物是被研究得最多的。已经利用多种方法鉴定到了多个底物。
转录因子
免疫MAPK底物半数都是转录因子,说明在免疫响应中免疫MAPKs在转录重编程中有着重要作用。in vitro 时MPK3、MPK4及MPK6不够磷酸化转录因子WRKY33,in vivo 条件下MPK3和MPK6引发的磷酸化也有相关研究进行报道。遗传分析表明在不同病原菌侵染时和MPK3/MPK6信号通路中WRKY33对camalexin的生物合成是至关重要的。在突变体WRKY33$^{SA}$中WRKY33中5个潜在的MAPK磷酸化位点被突变。WRKY33$^{SA}$中并没有wrky33 突变的表型,而且值得注意的是camalexin生物合成相关基因的激活效率更低。此外,WRKY33能和PAD3 的启动子进行结合,这表明WRKY33能够直接激活camalexin合成相关基因的表达。有趣的是,MPK3/MPK6信号调控WRKY33 的表达,WRKY33能够与其启动子结合,这表明在WRKY33 的表达中存在循坏调节。总之,camalexin的生物合成被MPK3/MPK6信号通过对WRKY33转录及转录后的调节明显地诱导。事实上,WRKY33还能与MPK4互作来控制camalexin的生物合成。WRKY33与MPK4和MKS1形成核复合物。flg22诱导或细菌侵染后,由MPK4引发的MKS1的磷酸化诱导MKS1-WRKY33复合物从MPK4中释放出来,从而激活PAD3 基因表达。此外,MKS1能够识别WRKY33中与DNA结合的WRKY结构域,刺激其与DNA的结合。然而,在突变体mks1 受到病原菌侵染后仍有camalexin的积累;PAD3 在mpk4 中表达稳,但在mks1中却被病原菌诱导表达。mks4 突变体中MKS1沉默表达后,矮化减轻。总之,MPK3/MPK6和MPK4-MKS1信号通过调节WRKY33来影响camalexin的生物合成,但是具体的crosstalk机制还不清楚。
in vivo 时MPK3与bZIP转录因子VIP1互作,而且在in vito 时能将其磷酸化。用不同的表达系VIP1、VIP1$^{S79A}$或VIP1$^{S79D}$试验表明VIP1和VIP1$^{S79A}$定位在细胞质和细胞核中,VIP1$^{S79D}$主要定位在细胞核中。flg22处理后,VIP1定位在细胞核中,但是VIP1$^{S79A}$没有定位在细胞核中。进一步的试验表明细胞核中的VUP1激活PR1 基因表达。这些结果表明flg22处理后,MPK3将VIP1磷酸化,这表明这个蛋白重定位到了细胞核中,然后激活PR1 基因表达。
MPK6能与ET响应因子家族中的ERF104互作,但是在flg22处理5-15min后这种互作关系就消失了。有意思的是,这个蛋白复合物的破裂需要MPK6活性和ET信号才能完成。in vitro 中MPK6磷酸化ERF104的C端结构域。ERF104过表达系转录组分析发现某些胁迫相关基因的表达上调了,尤其是防御素基因PDF1.2 。总之这些结果表明flg22处理后MPK6能够磷酸化ERF104,从而诱导ERF104的释放并激活其防御基因的表达。ERF104似乎是MPK6的一个特定的底物,但是ERF6等其他的ERF转录因子能够被MPK3和MPK6磷酸化。in vitro, 磷酸化主要发生在S266和/或S269;in vivo 分析发现B. cinerea 侵染时ERF6能够被S266和S269磷酸化。此外,活性烟草NtMEK2的诱导也能使拟南芥ERF6 S266和S269残基发生磷酸化,这表明MPK3和MPK6磷酸化了这些位点 in vivo。ERF6的硫酸化减弱了蛋白酶体介导的ERF6的降解。B. cinerea 侵染强烈诱导了ERF6的表达,这种诱导效应部分依赖于MPK3/MPK6信号,但是和ET信号无关。一个模拟磷酸化的突变体植株和野生型相比对B. cinerea 表现出更强的抗性,同时表现出不同于mpk4 突变体的严重的矮化。与此相反的是,一个dominant-negative ERF6突变体植株比野生型植株对B. cinerea表现出了更高的敏感性。他们研究还发现ERF6能作用于MPK3/MPK6信号的下游,诱导PDF1.1、PDF1.2a 等几个防御素基因的表达。总之,这些数据表明ERF6是MPK3和MPK6的一个底物,参与激活防御基因表达和真菌对病原菌的抗性。
其他底物
除了转录因子意外,还有一些具有多种细胞功能的免疫MAPK底物被鉴定到。in vitro,MPK6磷酸化ET生物合成限速酶1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶的两种同工型:ACS2和ACS6。在ACS6中被磷酸化的位点是S480、S483和S488。SCA6的一个更稳定的突变体ACS6$^{S480D/S483D/S488D}$能导致细胞ACS活性和ET生物合成增加。此外,遗传分析发现激活MPK6后,ACS2和ACS6都是生成高水平ET所必须的。同一研究组后来还发现MPK3也参与了同样的反应,并且发现其磷酸化的精确机制,进而通过泛素化-蛋白酶体机制来解释ACS蛋白的稳定性或降解机制。这个研究的数据表明MPK3和MPK6通过ACS2和ACS6的磷酸化来调节ET的生物合成。有趣的是,WRKY33能够与ACS2 和ACS6 的启动子直接结合 in vivo ,MPK3/MPK6信号很大程度上依赖WRKY33来诱导ACS2 和ACS6 的基因表达。因此,与WRKY33调控camalexin生物合成类似,MPK3/MPK6信号通过对ACS2和ACS6的转录级转录后的调节来调控ET的合成。
研究者利用蛋白质芯片筛选将串联锌指蛋白9(TZF9)鉴定为MPK3和MPK6的底物。Maldonado-Donilla等的研究进一步确证了这个结果,而且进一步表明MPK3和MPK6能够与TZF9在细胞质和细胞核中互作。TZF9原生质体顺势表达发现TZF9在flg22处理后发生磷酸化,磷酸化以后TZF9的蛋白稳定性可能发生变化。tzf9 突变体对MAMP诱导的抗性有部分衰减:ROA爆发降低、MAPK活性降低、FRK1 和NHL10防御表达降低。这些数据表明植物防御期间,MPK3和MPK6能够磷酸化TZF9,进而破坏蛋白稳定性、改变其可能参与的转录后的调控。
MPK6和MPK3(可能)与LIP5互作,都能磷酸化LIP5。病原菌侵染或MPK3/MPK6信号下,LIP5也会被磷酸化。lip5 突变体中flg22诱导的防御响应是正常的,但是对P. syringae 的基础抗性受损。LIP5中MAPK潜在的磷酸化位点突变会降低LIP5的稳定性。受到P. syringae 侵染后植株需要LIP5来增加多囊泡体的形成。总之,这些结果表明MPK3和MPK6磷酸化LIP5,磷酸化后的蛋白更稳定并且能够正向调节多囊泡体铁路,从而导致防御相关分子的重定位。
PHOS32和相关蛋白PHOS34在flg22处理后能够被迅速磷酸化,PHOS32中的磷酸化位点是S21。in vitro 激酶分析发现MPK3和MPK6能够磷酸化PHOS32,尤其是S21这个位点;进一步的免疫耗竭实验发现MPK3和MPK6是磷酸化这个位点的主要蛋白激酶。PHOS32和PHOS34都含有一个普遍的应激蛋白A结构域。但是PHOS32和PHOS34在植物防御中的具体功能、MPK3和MPK6引发的磷酸化的作用还没有新概念报道。
除了MPK3/4/6外,还有MPK11也有一定的功能。MPK11能与GRF6互作。 烟草共表达等试验发现MPK11磷酸化GRF6的丝氨酸残基。MPK11与GRF6共表达后GRF6的丰度降低,这表明MPK11会影响GRF的稳定性。此外,抗泛素化抗体试验发现GRF6会被泛素-蛋白酶系统降解。在水痘病毒李痘病毒(PPV)侵染后,mpk11 和grf6 分别表现更高的敏感性和抗性。总之,这些结果表明MPK11磷酸化GRF6从而导致其泛素-蛋白酶退化,对PPV抗性降低。
其他的MAPK底物
在其他条件下(病原侵染、非生物胁迫级其他)也鉴定到了MPK3/4/6的其他底物。这些底物中的一半以上都是转录因子。这些蛋白是转录因子EIN3、硝酸还原酶NIA2、bHLH转录因子SPCH、mRNA酶DCP1、转录因子MYB4和MYB44、转录因子HSFA2和HSFA4A、脂类转运蛋白相关的杂交富脯氨酸蛋白AZI1、bHLH转录因子MYC2、MAPK酸化酶MPK1、细胞骨架蛋白MAP65-1、C2H2型转录因子ZAT6及ZAT10。
中高通量分析中推定的MAPK底物
上述的MAPK底物主要是通过candidate approaches鉴定到的。与之相反的是,许多推定的底物都是从中/高通量分析中得到的,但是大多数都还需要进一步的实验来验证。Feiler等开发了包含1690个拟南芥蛋白的芯片,并将其与MPK3和MPK6进行孵育。得到48个MPK3的潜在底物、39个MPK6的潜在底物,有26个底物是共有的,其中是ACS6就是MPK3和MPK6的底物。其他的潜在底物是转录因子、核糖体蛋白、组蛋白及其他蛋白。Popescu等人利用含有2158个拟南芥蛋白的芯片并借助GO分析发现推定的底物中50.4% 是潜在的转录因子、35%是推定的核酸结合蛋白、16%是蛋白激酶。测试了10个不同的MAPKs后,发现570个蛋白是潜在的底物。
病原效应子靶向的MAPK模块
病原菌释放大量的效应子到寄主细胞中来抑制寄主免疫响应,MAPK模块是这些效应子主要的靶标。前面提到的HopAI1以MPK3/4/6为靶标。HopAI1通过其磷酸化酶活性来刺激这些MAPKs。P. syringae 的效应子与MPK4互作,诱导磷酸化并激活MPK4。此外,MPK4直接与RIN4互作并将其磷酸化。
文献信息
Title:Signaling Mechanisms in Pattern-Triggered Immunity (PTI)
译名:PTI中的信号机制
期刊:Molecular Plant
IF:12
链接:https://doi.org/10.1016/j.molp.2014.12.022
通讯作者:Heribert Hirt
主要单位:King Abdullah University of Science and Technology

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